一、MicroRNA原理介紹
MicroRNA（miRNA）是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA,是發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。其在細胞內具有多種重要的調節(jié)作用。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調節(jié)同一個基因。這種復雜的調節(jié)網(wǎng)絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達。
MicroRNA形式
1. pre-miRNA
約70bp含microRNA莖環(huán)結構的pre-miRNA。
制備方式：化學合成、生物轉錄合成、pre-miRNA質粒表達載體、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA
天然pri－miRNA
從染色體基因文庫中調取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到質粒載體（普通載體或病毒載體），以強大的CMV啟動子操縱該300bp－1000bp microRNA。
人工pri－miRNA
選擇一個完整的microRNA基因，克隆到質粒載體（普通載體或病毒載體）。以人工合成的約70bp含miRNA莖環(huán)結構的目標pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 啟動子操縱該microRNA結構單元。
三. MicroRNA選擇
★pre-miRNA是最早采用的microRNA，擁有大量的成功報道?；瘜W合成的pre-miRNA制備快捷，可以標記熒光等追蹤。缺點是制備的RNA穩(wěn)定性較差，而且，由于制備的microRNA較長，合成時RNA的錯誤難以避免（當合成RNA超過60bp時，出現(xiàn)一個堿基錯誤率約30％），轉錄制備的pre-miRNA穩(wěn)定性較好，但無flank結構，很少使用。質粒載體形式的pre－miRNA也因為發(fā)現(xiàn)microRNA的flank對于microRNA功能和測定非常重要，現(xiàn)已逐漸被pri-miRNA取代。
★人工pri-miRNA效果較pre-miRNA好，也有足夠多的成功使用的經(jīng)驗報道，但這種人工microRNA采用固定的mir155 flank，制備的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐漸較少使用。
★原始天然pri-miRNA克隆自天然文庫的microRNA由于保留了每個microRNA獨自的原始天然雙臂結構，效果更好，是近來被首選方法。
★pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以轉染大多數(shù)絕細胞，產(chǎn)品質量可靠。缺點是腺病毒有一定的毒性，以往實驗腺病毒毒性并未引起重視，但我們發(fā)現(xiàn)在microRNA實驗中顯得比較突出。另外，制備周期長，費用高也是不容忽視的缺點。
★慢病毒microRNA：目前最好的microRNA實驗產(chǎn)品，缺點是慢病毒自身的不足，即制備lenti－virus時，病毒的質量批間差異較大。
★AAV、或retrovirus microRNA：與腺病毒和lenti－virus microRNA一樣，具有病毒產(chǎn)品的優(yōu)勢與缺點。
四. MicroRNA產(chǎn)品
| 產(chǎn)品 | 制備方式 | 大小 | |
| Pri-microRNA | 天然Pri-microRNA庫 質粒載體 病毒：腺病毒/慢病毒 |
300－1000 bp | |
| 人工Pri-microRNA庫/訂制 質粒載體 病毒：腺病毒/慢病毒 |
約500 bp | ||
| Pre-microRNA | 合成 化學合成或生物轉錄 |
約70bp | |
| 載體 質粒載體 病毒：腺病毒/慢病毒 |
|||
1. pri－miRNA庫
★所有的pri-miRNA都是從人類基因組DNA中擴增出來的，其長度大約為300bp－1000bp。
★microRNA完全忠實于細胞內的天然結構,具有更高的效率。
★microRNA表達質粒載體，可以直接使用。microRNA轉錄結構單元已經(jīng)構建到基于FIV的慢病毒載體，同時與晶賽公司的腺病毒系統(tǒng)完全兼容，方便制備病毒。
★EGFP和miRNA在CMV啟動子的引導下共表達。
★microRNA質粒經(jīng)過嚴格測序。
★部分制備的microRNA質?；虿《窘?jīng)過生物學測定，microRNA效果肯定與明確。
★已經(jīng)完成microRNA列表(部分)，請Email咨詢查找其它的miRNA。
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miRNA名稱 |
測序結果 |
miRNA大小 |
載體 |
生物學測定 |
|
1 |
hsa-mir-98 |
ok |
562 |
B |
Ok |
|
2 |
hsa-mir-96 |
ok |
511 |
B |
Ok |
|
3 |
hsa-mir-95 |
ok |
495 |
B |
Ok |
|
4 |
hsa-mir-17-92 |
ok |
978 |
L |
Ok |
|
…… |
…… |
…… |
…… |
…… |
|
|
513 |
hsa-mir-18a |
序列錯誤 |
681 |
L |
Ok |
|
514 |
hsa-mir-345 |
一個突變 |
548 |
L |
Ok |
|
515 |
hsa-mir-589 |
Ok |
620 |
L |
Ok |
|
516 |
hsa-mir-219-2 |
Ok |
610 |
L |
|
|
517 |
hsa-mir-215 |
ok |
458 |
L |
Ok |
|
518 |
hsa-mir-212 |
一個突變 |
474 |
L |
Ok |
|
...繼續(xù)中 |
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B：同時有質粒、慢病毒質粒載體和腺病毒質粒載體；
L：僅有慢病毒載體?？筛鶕?jù)要求改構到您希望的載體。
更多及詳細microRNA情報請通過Email：tech@bluegene.cc咨詢。
更多新發(fā)現(xiàn)的microRNA請參見MiRBase：http://microrna.sanger.ac.uk/
2. pri－miRNA或pre－miRNA載體/載體構建服務
★BG有256個構建好的pre－miRNA。
★pre-microRNA表達質粒構建
①microRNA轉錄結構單元通過增強型Pol III 啟動子（hU6, hH1, h7SK, mU6）引導pre-miRNA的過表達。
?、诳蛇x擇帶EGFP熒光標簽。
?、劢K產(chǎn)品均經(jīng)過嚴格測序。
?、茌d體類型：和siRNA一樣，microRNA的效率只與“啟動子－miRNA－終止信號”轉錄結構單元有關，因此任何質粒microRNA作用效果應該基本一致，質粒小一些對于細胞轉染效率略有好處。晶賽公司的microRNA質粒與腺病毒、慢病毒系統(tǒng)完全兼容，許多表達載體已包裝成腺病毒及慢病毒，有數(shù)十種載體可供選擇，請Email咨詢載體情報。這種pre－microRNA存在不足，請參考MicroRNA簡介中有關部分。
★pri－microRNA表達質粒
①pre-microRNA＋mir155的microRNA兩臂共同組成pri-microRNA。
質?？捎糜谥苯又苽浠贔IV的慢病毒，并同時與晶賽公司的腺病毒系統(tǒng)完全兼容。
?、贓GFP和miRNA在CMV啟動子的引導下共表達。
?、劢K產(chǎn)品均經(jīng)過嚴格測序。
?、茌d體類型：和siRNA一樣，microRNA的效率只與“啟動子－miRNA－終止信號”轉錄結構單元有關，因此任何質粒microRNA作用效果應該基本一致，質粒小一些對于細胞轉染效率略有好處。晶賽公司的microRNA質粒與腺病毒、慢病毒系統(tǒng)完全兼容，許多表達載體已包裝成腺病毒及慢病毒，有數(shù)十種載體可供選擇，請Email咨詢載體情報。這種pre－microRNA存在不足，請參考MicroRNA簡介中有關部分。
3. 生物轉錄合成microRNA
產(chǎn)品形式為70bp左右的pre-microRNA。
生物合成的microRNA有較之化學合成的microRNA有更高的穩(wěn)定性及效率。以晶賽專利的高保真RNA生物合成技術為基礎的microRNA產(chǎn)品有著迄今最好的正確率，從而確保您實驗的成功。這種pre－microRNA存在不足，請參考MicroRNA簡介中有關部分。
4. 化學合成的microRNA
產(chǎn)品形式為70bp左右的pre-microRNA。
化學合成非?？旖荩ㄙ徱恢芎缶涂梢蚤_始您的實驗。這種pre－microRNA存在不足，請參考MicroRNA簡介中有關部分。
5. MicroRNA病毒載體
腺病毒MicroRNA
全部MicroRNA產(chǎn)品均能夠以腺病毒形式提供。
慢病毒MicroRNA
提供慢病毒MicroRNA質粒、轉染試劑、包裝細胞，操作方法。您可以方便地自己制備慢病毒。
五. 服務價格
天然pri－microRNA：2900元/50 ug microRNA，包括質粒對照。
Pre－microRNA載體構建：1900元/50 ug microRNA，包括質粒對照。
其它形式的microRNA，請咨詢。
